打破教科书!Nature子刊:蛋白质组+转录组+单细胞测序发现全新的T细胞反应谱,有望揭秘免疫疾病!-环球风云-资讯-生物在线

打破教科书!Nature子刊:蛋白质组+转录组+单细胞测序发现全新的T细胞反应谱,有望揭秘免疫疾病!

作者:上海吉凯基因医学科技股份有限公司 2021-09-01T13:22 (访问量:12615)

免疫细胞之间的交流由细胞因子介导,细胞因子促进细胞分化为效应型细胞。特别地,初始CD4+T细胞可被细胞因子极化成辅助性T(Th)表型,包括Th1、Th2和Th17,进而发挥作用。当前人们对细胞因子刺激的初始CD4+ T细胞分化有较深入的研究,而记忆性T细胞的细胞因子响应(或极化)却很少被研究。

英国研究团队在《Nature Communications》(IF:14.919,中科院JCR 1区)上发表了题为“Single-cell transcriptomics identifies an effectorness gradient shaping the response of CD4+T cells to cytokines”的研究论文。研究表明,CD4+ T细胞激活和细胞因子反应受效应梯度的影响。

总体技术路线
初始(TN)和记忆(TM) CD4+ T细胞在不同细胞因子混合物的存在下,用抗CD3/抗CD28包被的beads刺激CD4+ T细胞,将TN和TM分化为四种辅助性表型(Th1、Th2、Th17和iTreg),及干扰素-β型(IFNβ)。在刺激16小时(细胞增殖前)和刺激后5天(细胞获得效应表型),收集细胞并进行RNA测序、蛋白质组学(非标记LC-MS/MS)和单细胞测序。





研究结果

  • 转录组和蛋白质组:揭示激活TN和TM诱导的细胞类型特异性响应
由RNA测序和蛋白组的PCA分析可知,T细胞激活与否是转录组和蛋白组差异变化的主要原因(下图c)。细胞按细胞因子刺激时间长短和细胞类型进行聚集,提示我们T细胞对激活的响应是动态和细胞特异性的。比较TN组和TM组中的激活和未激活(即Th0比静息)的转录组和蛋白组(下图d),在RNA水平上,16小时后TN和TM中分别有8333和7181个mRNA差异表达。在细胞因子处理五天后为TN组7705个差异mRNA和TM组7544个差异mRNA。在蛋白质水平上,在TN和TM中,5天后分别有4009和3443个蛋白质差异表达。上调差异基因富集在细胞周期进程和I型干扰素反应,下调差异基因富集在呼吸链复合体(下图e)。


  • 转录组和蛋白质组:揭示细胞因子刺激TN和TM诱导的细胞类型特异性响应
为了研究细胞因子刺激如何调节TN和TM的基因表达,先对蛋白质组和转录组进行PCA分析,发现转录组和蛋白质组在细胞因子刺激5天时有明显的聚集。基因表达的早期变化由T细胞激活主导,而分化的Th细胞的表达程序仅在刺激的后期才明显。这意味着细胞因子极化(即细胞因子诱导的分化)发生在T细胞活化开始后。随后作者聚焦于细胞因子刺激5天后的数据。Th2刺激引发了两种细胞类型之间的不同反应,TN组中有944个mRNA的差异表达,而TM组中为49个。在蛋白质水平上观察到相同的趋势,其中290种蛋白质在TN组中差异表达,但在TM组中没有检测到差异。这表明记忆性CD4+T细胞(TM)不能向Th2表型极化。同时作者还发现,初始CD4+T细胞(TN)在Th17和iTreg极化时获得不同的表型,但两种细胞因子刺激下使记忆性CD4+T细胞(TM)向相同的细胞状态极化。



  • 细胞类型特异型基因特征
通过前面的分析,作者明确了细胞因子刺激在不同T细胞中,诱导出了不同状态的细胞:
TN组:5种细胞状态,分别是Th1、 Th2、Th17、iTreg和 IFN-β;
TM组:3种细胞状态,分别是Th1、 Th17/iTreg 和 IFN-β(因为Th2 无响应)。
作者分析了TN组和TM组中各细胞类型的特征基因(下图),共鉴定到TN组的105个特征基因和TM组的162个特征基因。


  • 单细胞测序:揭示T细胞效应梯度
考虑到初始CD4+T细胞(TN)的细胞组成一致,而记忆性CD4+T细胞(TM)存在异质性。因此,就TM对细胞因子表现出的响应,有两种假设:(1)TM细胞作为一个整体对某些细胞因子无反应;(2)TM的一个亚群对细胞因子有反应,但基因表达谱被大部分无反应的细胞主导。

为了解决这个问题,作者对TN组和TM组的细胞进行了单细胞测序,包括静息细胞、Th0细胞、Th2细胞、Th17细胞和iTreg刺激细胞。结果显示静息的CD4+T细胞是一个具有多个相关转录状态的连续体。为了研究这些状态之间的关系,作者应用拟时分析并观察到细胞形成了从TN开始并逐渐向TM发展的连续进程。该轨迹开始时的细胞表达高水平的初始标记物(如SELL、CCR7和LRRN3),而轨迹结束时是富含表达细胞毒性分子(如GZMA、GZMB和PRF1)和细胞因子及趋化因子(IL32、CCL4和CCL5)的细胞。簇标记证实CD4+ T细胞形成自然进程,从初始T细胞(TN)开始,向中枢记忆性CD4+T细胞(TCM)推进,然后是效应记忆性CD4+T细胞(TEM),最后是高度效应记忆性T细胞(TEMRA),nTreg细胞向外分支。作者将这种快速反应的性质定义为T细胞效应。随后,作者通过分析已发表文献中CD4+T细胞和配对TCR测序的结果,明确了T细胞效应是T细胞活化的结果,并伴随有TCR的克隆扩增,而与抗原特异性无关



  • T细胞效应决定T细胞对激活的响应
作者随后分析了效应梯度是否会影响T细胞对激活的响应。首先,对TN和TM在激活条件下(T0)的单细胞测序数据进行拟时分析,发现了和静息细胞轨迹相同的拟时轨迹——从TN到TM的进展,一些基因的表达也随着拟时顺序变化。不管T细胞激活与否,都可以检测到T细胞效应。效应值最低的细胞定位于初始CD4+T细胞(TN)区域,而效应值较高的细胞定位于中枢记忆性CD4+T细胞(TCM)、效应记忆性CD4+T细胞(TEM)和再表达CD45RA的效应记忆性CD4+T细胞(TEMRA)区域。



  • T细胞效应决定T细胞对细胞因子的响应
接下来作者评估了T细胞效应是否影响T细胞对细胞因子极化的响应。作者分析了Th2、Th17和iTreg刺激的TN和TM的单细胞测序结果。和预期一致,这种分布与效应梯度相关(下图a),表明T细胞效应是基因表达变异的最强驱动因素之一。除了效应这个因素外,不同细胞因子刺激的TN和TM也定位于UMAP空间的不同区域,表明细胞因子极化产生不同的T细胞状态,是转录变异的第二个主要驱动因素。


为了了解T细胞效应如何影响T细胞对细胞因子的反应。作者共确定了210个与效应显著相关的基因。其中,大多数(203个基因)进一步受到细胞因子的调控。作者又根据效应大小筛选基因,确定了24个在所有细胞因子刺激下都具有强效应的基因,并通过已发表文献和实验对其进行了验证。


总结

作者通过比较初始CD4+T细胞(TM)和记忆性CD4+ T细胞(TN)在不同细胞因子刺激后的转录组和蛋白组发现记忆CD4+ T细胞(TM)不能分化为Th2表型,并在对iTreg极化的反应中获得Th17样表型,这是TM细胞的统一特征。通过单细胞测序,作者发现T细胞构成了一个从初始CD4+T细胞(TN)发展到中枢记忆性CD4+T细胞(TCM)和效应记忆性CD4+T细胞(TEM)的转录连续体,表现为一种效应梯度。这个效应梯度是由细胞因子、趋化因子和颗粒酶基因的表达决定的,并影响细胞对细胞因子极化的反应。

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