不知各位小伙伴在做荧光定量qPCR实验的时候有没有遇到过以下这些情况？
主峰左边有杂峰，疑似引物二聚体
主峰右边有杂峰，疑似非特异扩增
基因表达无差异
每当出现这些情况，就意味着可能要重新做实验。为确保下一次实验不出错，了解其原因十分重要，可能是体系污染导致，也可能是扩增特异性不足导致。在这里小翌教大家从引物设计的角度提升扩增特异性！
在进行qPCR引物设计时，相信有不少小伙伴听过类似“跨内含子设计”的要求，那么，要跨内含子设计是啥？为什么要跨内含子设计呢？
以人基因组来说，平均每个基因有8.8个外显子和7.8个内含子，80%的外显子长度小于200bp，少于10%的内含子长度在1100bp以上，不到0.01%的内含子长度小于20bp。
我们在进行一些荧光定量qPCR实验之前，需要提取RNA和反转录合成cDNA，cDNA作为模板用于分析基因表达情况。故在DNA序列上设计引物需避开内含子序列区域，选用外显子区域序列用于引物设计。看到这，有小伙伴会有疑问，那为啥不叫“外显子设计”或者“去内含子设计”呢，为啥要称为“跨内含子设计”？
是的，引物还需要跨内含子，在设计引物时需要让一端引物或者两端引物跨越内含子，否则荧光定量qPCR的熔解曲线可能出现双峰或者多峰。
在单个外显子上进行上下游引物设计
在这种情况下，由于产物序列一致且大小一致，从熔解曲线上难以分辨，看上去都是单一的熔解峰，但是在进行数据分析时，往往会有一种感觉，就是基因表达无差异或者差异结果不稳定。
在两个外显子上进行上下游引物设计
在这种情况下，产物差距就比较大了，基因组DNA(gDNA)扩增产物较cDNA扩增产物更长，熔解温度(Tm值)更大，在熔解曲线上表现出来则是主峰右侧的杂峰。当然还有一种情况，当以gDNA为模板所需扩增的片段很长，难以扩增，最终产物相对单一，熔解曲线峰也是相对单一的。
建议的上下游引物设计方式
引物跨内含子设计后，对于引物序列本身还有什么要求呢？接下来小翌给大家分享引物设计原则~
qPCR引物设计原则
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参考项 |
标准参考 |
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产物长度 |
80-300bp |
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引物长度 |
17-25 base |
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GC含量 |
40-60%（45-55%为最佳） |
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Tm值 |
上游引物F和下游引物R的Tm值不能相差太大，最好不超过1℃。 |
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引物序列 |
A、T、C、G整体分布尽量均匀。避开T/C或A/G的连续结构。 |
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3末端序列 |
避免GC rich或AT rich。3端碱基最好为G或C，尽量避免末端碱基为T。 |
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互补序列 |
避开引物内部或两条引物之间有3个碱基以上的互补序列。 两条引物间的3末端避开有2个碱基以上的互补序列。 |
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特异性 |
使用BLAST检索确认引物的特异性。 |
01
产物长度
首选的产物扩增长度为80-200bp，必要时可选择加长。通常扩增效率随着扩增产物长度增大而减小。但是不能太短，否则难以区分是引物二聚体还是扩增产物。
02
末端序列
引物末端最好是G或C，因为GC碱基之间是三个氢键连接，能够保证引物和模板连接的稳定性。
03
互补序列
引物3端通常是DNA聚合酶延伸的起点，如果两条引物在3端互补性过高，则更易形成引物二聚体，从而降低PCR的扩增效率和特异性。
若引物自身的互补性高，则会发生自身退火，形成发夹结构，或者两条一样的引物形成二聚体，从而降低PCR的扩增效率和特异性。
聊完了原则上qPCR引物如何设计之后，接下来让我们进入小伙伴们最为关注的实战操作。在这里小翌给大家介绍三种方式设计qPCR引物！
Primer3Plus
网址链接：https://www.primer3plus.com
01
Load server settings 选择qPCR，后上传设计引物的序列或粘贴需要设计引物的序列。按照自己的引物设计需求，选择使用排除的区域Excluded Regions、目的扩增区域Targets和包含区域Included Region。
02
点击General Settings按照荧光定量qPCR引物设计原则进行相关参数设置，例如扩增产物长度Primer Size Ranges、引物长度Primer Size、Tm值Primer Tm、GC含量Primer GC%。完成相关参数设置后，点击右上方绿色按钮Pick Primers，即可获得相关引物。
03
获得相关引物序列后，到NCBI blast ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物特异性验证。
Primerbank
网址链接：https://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/
它是哈佛大学的一个PCR引物数据库，包含 306,800 多种引物，涵盖大多数已知的人类和小鼠基因。通过 Real Time PCR 测试了与 27681 个小鼠基因相对应的 26855 对引物，然后对 PCR 产物进行琼脂糖凝胶电泳和测序。根据琼脂糖凝胶电泳结果，设计成功率为 82.6%（22187 对引物）。
01
首先在NCBI上找到目的基因的gene ID，例如，这里选用老鼠基因IL6的gene ID 16193。
02
Search by选择 NCBI Gene ID，Species选择Mouse，输入16193，点击Submit，即可获得相关引物。
03
相关引物还有已验证的可视化结果。
NCBI
网站链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov
01
打开NCBI，选择“Gene”，输入想要检测的基因名称，我们以人基因“ALAD”为例。
02
会出现很多搜索结果，我们选择需要的种属来源，即“human”，如果你知道Gene ID（每个基因有且只有一个特定的ID，类似于人的身份证），也可以根据Gene ID来选择。这里我们选择搜索结果中的第一个。
03
点开之后，会出现很长的页面，耐心往下拉，找到“mRNA and Protein（s）”栏下的NM编号，不同的NM编号，代表不同的isoform。选择想要检测的那一个。
确定NM号点击后，可以看到这个isoform的一些基本信息。
例如：gene代表基因长度3129bp，CDS代表编码蛋白区域149-1141bp。
以及此基因的序列，如下图所示。此序列就是设计引物时对应的模板。
04
了解完我们所需的isoform后，我们可以点击右侧的“Pick Primers”，就能直接进入Primer-BLAST的页面进行引物设计了。
05
在弹出来的界面里粘贴模板序列或者输入基因序列号。另外需要设置“上下游引物位置”和“扩增子长度”。最主要的设置就是这两点了，另外还有“物种名称”、“数据库”等其他选项可以设置。
设置好之后，点击页面左下角的“Get Primers”。
多对引物，选择合适的引物即可。
06
获得相关引物序列后，到NCBI blast ( https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)进行引物特异性验证。
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