本期主题是教你如何寻找肿瘤早期诊断biomarker，主要是采用提取相应样本中外泌体进行RNA测序，结合生物信息学分析，获得与相应肿瘤相关的RNA分子标记，再通过大样品的验证获得筛选肿瘤诊断的分子标记物。什么？你听不懂小编说的是啥？那你一定没有好好学习小编之前呕心沥血发的外泌体相关的知识，文章末尾有相应连接，大家自己去复习吧

不废话了，下面我们以昨天案例中的肾癌为例，给大家介绍一下如何寻找肿瘤早期诊断的分子标记物

一、样本制备

1.样本选择

为筛选肾癌病人外泌体中的特异性非编码RNA(miRNA/lncRNA)，作为肾癌早期的诊断标志物，因此可选择肾癌病人样本为实验组（最好是肾癌早期），正常人样本为对照组，如有条件建议增加肾良性肿瘤如肾囊肿、肾血管平滑肌脂肪瘤、肾上腺瘤黄色肉芽肿等，在临床诊断容易误诊为肾癌的其他肾病作为条件对照，进一步可区分肾癌与其他肾疾病，改善标志物的特异性，增加临床应用价值和医学意义。

图１　样本设置

Notice：注意实验组与对照组之间的年龄阶段，性别比例的匹配性，尽量减少背景差异

2.样本数目建议

由于检测的样本是来自于不同的患病个体，具有较大的遗传差异。同时，不同病例来源的外泌体因治疗方案，健康状态，年龄阶段等非实验因素的干扰，需要一定数量的样本减少实验误差，所以设计实验时尽可能将样本数设置的大一些。

图２　样本数量

3.样本材料

⑴尿液。尿液由肾小球过滤产生，含有尿素及少量的无机盐、蛋白质等，若肾脏出现病变，尿液中的成分将会改变，能反映肾脏的病变。取尿液作为诊断样本是一种完全非侵入性采样，相比于其他手术取病理组织，穿刺取样等侵入性手段有很大优势。并且外泌体在尿液中含量较高，已有商品化的试剂盒能方便分离提取。尿液来源的外泌体非编码RNA（miRNA、lncRNA）作为泌尿系统相关疾病的生物标志物已有一些报道。

⑵外周血清/血浆。血液是疾病诊断的良好样本，具有取样方便，操作简单，可检测指标多样，能客观反映疾病的变化的诸多优点。血液已在疾病诊断广范应用，血常规检查已成为临床检查的重要手段。血液外泌体来源的非编码RNA（miRNA、lncRNA）已在多种癌症中发现作为标志物。

二.技术路线

样本收集→外泌体分离富集→RNA提取→建库→上级测序→生物信息分析

1.根据实验设计选择收集尿液、血清/血浆或细胞培养上清样本。

2.采用SBI外泌体试剂盒富集样本的外泌体exosome。通过外泌体的表面特异标志蛋白 CD63、CD9等鉴定外泌体。

3.外泌体由脂质、蛋白质，RNA 等多种成分组成，可根据研究目的，对富集后的外泌体进行组分分离提取，分别研究，本实验分离外泌体的RNA，采用Trizol 提取方法。

4..根据测序的对象microRNA 或lncRNA采用对应的微量建库方法。

5.上机测序，然后对获得的数据做完质量控制后进行下游的生物信息学分析。

三.实验思路总结

图３　整体研究思路

四．外泌体RNA测序结果——生物信息学分析介绍

举例说明比较重要生物信息分析——基于Kyoto encyclopedia of genes and genomes（KEGG）生物学通路数据库的生物通路（Biological Pathway）分析

代谢通路和信号通路是生物功能的两大重要实现方式，该分析从复杂调控网络的角度出发，对基因集合进行生物通路富集分析。我们将候选的编码基因放到生物通路中进行综合分析，表达差异基因行使某同一重要功能落在同一生物通路上的概率较大。

图４　ＫＥＧＧ分析结果

当然，生物信息学分析不止这一项，还有很多项目，这里就不给大家一一介绍了。总之，经过生信分析人员的解读之后，你得到不不仅仅是数据，还有美美的图片，可以完美阐释测序结果，这些你都值得拥有哦~

本期的思路解析就说到这里了，有没有Get到你想到的idea呢？有没有灵光乍现呢？没有也没关系，下周我们会继续解读一些外泌体相关的文献及相关的实验设计思路，记得来学习哦~